Sterilisation von Flüssigkeiten, Festkörpern und Abfällen

PR-Gateway schreibt "Der richtige Autoklav?

Der Sterilisationsprozess in einem Autoklaven (Dampfsterilisator) kann sehr diffizil sein. Werden zum Beispiel Flüssigkeiten oder Festkörper (Instrumente, Glaswaren, Filter, Textilien) sterilisiert, um diese später im Labor zu verwenden, muss der Sterilisationsprozess ein reproduzierbar, zu jeder Zeit, steriles Produkt sicherstellen. Produkte, die für die Verwendung im Labor sterilisiert werden, können nicht auf Sterilität geprüft werden, da diese durch die Prüfung kontaminiert werden und somit nicht mehr im Labor verwendbar sind.

Die Validierung von Dampfsterilisationsprozessen ist ein zunehmend wichtiges Thema um nachweislich reproduzierbare Ergebnisse sicherzustellen. Des Weiteren sind bei der Dampfsterilisation generell, im speziellen aber bei der Sterilisation von Flüssigkeiten, Sicherheitsaspekte zu beachten. In der Regel wird bei einer Temperatur von 121C sterilisiert. Dies entspricht einem Dampfdruck von ca. 2bar. Diese hohen Temperaturen mit dem damit verbundenen Druck können ein erhebliches Gefahrenpotenzial für den Anwender bergen wenn der Dampfsterilisationsprozess fehlerhaft ausgelegt ist beziehungsweise fehlerhaft ausgeführt wird.

Sterilisieren von Flüssigkeiten und flüssigen Abfällen in Flaschen

Das Sterilisieren von Flüssigkeiten ist eine der anspruchsvollsten Aufgaben im Labor. Die Sterilisationsprozesse können mitunter sehr lange dauern, Flaschen müssen offen oder zumindest angelüftet sein, ein Teil der Flüssigkeit verkocht, Flüssigkeiten können überkochen und Flaschen können sogar bersten. Eine weitere Frage, die gestellt werden muss, ist, ob die Flüssigkeiten in den Flaschen überhaupt die gewünschte Sterilisationstemperatur (z.B. 121C) erreichen und wann diese nach Beendigung des Sterilisationsprozesses auch sicher dem Autoklaven entnommen werden können.

Schaut man sich einen Sterilisationsprozess für Flüssigkeiten an, besteht dieser aus drei Phasen:

- Aufheizphase und Ausgleichzeit (H)

- Sterilisierphase, z.B. 121C für 20 Minuten (S)

- Kühlphase auf eine sichere Entnahmetemperatur (C)

Abbildung 1 veranschaulicht die einzelnen Phasen grafisch.

Die blaue Linie stellt hierbei die Temperatur im Druckbehälter des Autoklaven dar, die rote Linie die Temperatur in der Flüssigkeit. Es ist deutlich zu sehen, dass im Druckbehälter des Autoklaven sehr schnell die gewünschte Temperatur von 121C erreicht wird während die Flüssigkeiten in den Flaschen deutlich länger benötigen, um die Sterilisiertemperatur zu erreichen. Die Wärmeenergie des Dampfes wird in der Aufheizzeit durch Kondensation des Dampfes auf den Flaschen übertragen. Dieser Kondensationsprozess und der damit verbundene Wärmeübergang benötigt einige Zeit, was den Zeitunterschied zwischen dem bloßen Aufheizen des Druckbehälters und dem Aufheizen der Flüssigkeit selber erklärt. Die Zeit, die benötigt wird, gleiche Temperaturen im Druckbehälter des Autoklaven und in den Flüssigkeiten zu erreichen wird als Ausgleichszeit bezeichnet.

Viele heute im Labor verwendeten Autoklaven sind nach wie vor nicht mit einer Temperaturmessung in einem Referenzgefäß ausgestattet. Die genaue Temperatur der zu sterilisierenden Flüssigkeit wird also nicht erfasst und kann somit auch nicht zu Regelung des Sterilisationsprozesses herangezogen werden. Diese Autoklaven starten die Sterilisierzeit wenn die gewünschte Temperatur im Druckbehälter des Autoklaven erreicht ist. Die Ausgleichszeit, die benötigt wird, damit auch die Flüssigkeiten die gewünschte Temperatur erreichen, wird hierbei nicht berücksichtigt. Die Flüssigkeiten erreichen also nie die Sterilisationstemperatur von z.B. 121C und somit ist die biologische Wirksamkeit des Sterilisationsprozesses nicht mehr gegeben. Je nach Resistenz der zu inaktivierenden Mikroorganismen werden diese nur teilweise oder gar nicht inaktiviert.

Temperaturmessung in einem Referenzgefäß

Durch Messung der Temperatur in einem Referenzgefäß mittels eines Temperatursensors, kann die genaue Temperatur der zu sterilisierenden Flüssigkeit ermittelt und auch zur Regelung des Sterilisationsprozesses herangezogen werden. Die Sterilisierzeit startet nur dann, wenn die gewünschte Sterilisations-temperatur in der Flüssigkeit erreicht ist.Das Referenzgefäß wird hierfür mit Wasser gefüllt. Wichtig ist, dass Größe und Füllstand des Referenzgefäßes dem des größten Gefäßes gefüllt mit der zu sterilisierenden Flüssigkeit entsprechen muss.

Sichere Entnahmetemperatur

Der Temperatursensor zur Messung in einem Referenzgefäß wird also benötigt, um das Erreichen der Sterilisationstemperatur in der Flüssigkeit sicherzustellen. Dieser wird aber auch benötigt, um eine sichere Entnahmetemperatur nach erfolgter Sterilisation zu gewährleisten. In einem Autoklaven werden Flüssigkeiten deutlich über den normalen Siedepunkt (100C) aufgeheizt. Durch die in die Flüssigkeit eingetragene Wärme verbunden mit dem dazugehörigen Überdruck, können erhebliche Gefahren für den Bediener eines Autoklaven ausgehen. So kann es zum Beispiel zu einem Siedeverzug kommen, das heißt, dass die Flüssigkeit beim Öffnen des Autoklaven spontan anfängt zu kochen. Dieses spontane Kochen erzeugt eine Druckwelle aus Dampf und heißer Flüssigkeit, die ähnlich einem Geysir, aus den Gefäßen schießt. 1 Liter Wasser erzeugt 1000 Liter Dampf! Aufgrund dieses erheblichen Gefährdungspotenzials, unterliegen Dampfsterilisatoren die für das Sterilisieren von Flüssigkeiten eingesetzt werden, entsprechenden Regularien. DIN EN 61010-2-040 fordert, dass Dampfsterilisatoren für die Sterilisation von Flüssigkeiten mit Sicherheitseinrichtungen ausgestattet sein müssen, die ein Öffnen des Autoklaven verhindern, solange die Flüssigkeiten nicht auf eine für den Anwender sichere Entnahmetemperatur abgekühlt sind. Eine sichere Entnahmetemperatur definiert die Norm mit 20K unterhalb des Siedepunktes von Wasser bei atmosphärischen Umgebungsdruck. Dies entspricht einer sicheren Entnahmetemperatur von 80C. Moderne Autoklaven sind mit einer Temperatur- und Druckabhängigen Türverriegelung ausgestattet. Diese verhindert ein Öffnen des Autoklaven solange der Druckbehälter unter Druck steht und solange die in der Flüssigkeit gemessene Temperatur oberhalb der geforderten 80C liegt.

Das Kühlen der Flüssigkeiten auf die sichere Entnahmetemperatur kann sehr lange dauern. Eine häufig verwendete Größe für Autoklaven in Laboren ist ein Autoklav mit einem Fassungsvermögen des Druckbehälters von ca. 150 Litern. Wird ein solcher Autoklav voll beladen mit Flaschen in denen sich die zu sterilisierende Flüssigkeit befindet, kann ein gesamter Sterilisationszyklus bis zu 10 Stunden dauern. Das heißt, dass an einem Arbeitstag nicht mal ein Sterilisationsprozess vollständig durchgeführt werden kann. Daher empfiehlt es sich, den Autoklaven mit einem Rückkühlsystem auszustatten, dass die gesamte Chargenzeit erheblich reduziert und weitere Gefahren und Nachteile bei der Sterilisation von Flüssigkeiten beseitigt.

Schnellrückkühlung - Produktivität und Sicherheit maximieren

Bei für Autoklaven erhältlichen Rückkühlsystemen müssen grundsätzlich zwei Arten von Kühlsystemen unterschieden werden.

- Kühlung durch Evaporation - durch Kochen der Flüssigkeit in der Kühlphase

- Kühlung durch Radiation - durch Abstrahlung der Wärme aus der Flüssigkeit, ein Kochen der Flüssigkeit findet bei diesem Kühlsystem nicht statt.

Die Kühlung durch Evaporation ist wohl die am häufigsten verwendete Art der Kühlung in einem Autoklaven. Dies können z.B. sein:

- Selbstabkühlung durch langsamen Dampfablass

- Ventilationskühlung - kalte Raumluft wird mittels eines Ventilators von außen an den Druckbehälter geblasen

- Wasserkühlung ohne Stützdruck

Alle oben genannten Arten der Kühlung haben gravierende Nachteile bei der Sterilisation von Flüssigkeiten und können, wenn der Sterilisationsprozess nicht richtig durchgeführt wird, ein erhebliches Gefahrenpotenzial beinhalten, da diese Art der Kühlung ein Kochen der zu kühlenden Flüssigkeit erfordert.

- Durch das Kochen der Flüssigkeit in der Kühlphase, geht ein Teil der Flüssigkeit verloren. Der zu erwartende Flüssigkeitsverlust liegt in der Regel zwischen 3 und 10%, kann aber deutlich höher ausfallen, je nach Inhaltsstoffen in der Flüssigkeit. Speziell wenn der Proteingehalt in der Flüssigkeit hoch ist, neigt diese zu stärkerem Kochen, was den Flüssigkeitsverlust steigen lässt.

- Da die Flüssigkeiten zur Abkühlung kochen müssen, ist die Wahrscheinlichkeit hoch, dass diese überkochen. Daher werden die Flaschen nur zu einem Drittel oder halb gefüllt, um ein Überkochen zu verhindern. Zum einen ist dies ein erheblicher Produktivitätsverlust, da 50 bis 70% der verfügbaren Kapazität (in den Flaschen) verloren geht. Zum anderen kann das Überkochen nicht zuverlässig verhindert werden. Kochen die Flüssigkeiten über, muss der Autoklav aufwändig gereinigt werden, bis hin, dass zum Beispiel Agar-Basierte Flüssigkeiten in das Rohrsystem (Abfluss) des Autoklaven gelangen können und dieses dann verstopfen kann wenn der Agar dort auskühlt und fest wird. Eine Reinigung des Rohrsystems ist dann häufig nur noch sehr Aufwändig durch den Hersteller des Autoklaven möglich.

- Ein Kochen der Flüssigkeit ist nur aus offenen Flaschen heraus möglich. Daher müssen die Flaschen offen oder zumindest angelüftet (Deckel wird leicht geöffnet) sein. Wird das anlüften der Flaschen vergessen oder nicht richtig durchgeführt, kann die enthaltene Flüssigkeit in der Rückkühlphase nicht kochen und kühlt somit nicht ab. Hat das Referenzgefäß die Kühltemperatur von 80C erreicht und erlaubt somit das Öffnen des Autoklaven, ist/sind die fest verschlossenen Flasche/n noch immer auf Sterilisationstemperatur mit dem dazugehörigen Druck, z.B. 121C, 2bar. Dies stellt ein erhebliches Risiko dar, da diese Flaschen beim Entladen des Autoklaven explodieren können und die darin enthaltene Flüssigkeit, ähnlich dem Siedeverzug, spontan verdampfen kann. 1 Liter Wasser erzeugt 1000 Liter Dampf!

Es empfiehlt sich also, bei der Beschaffung eines Autoklaven genau zu definieren, für welche Applikationen dieser genutzt werden und wie dieser in Bezug auf Produktivität und Sicherheit ausgestattet sein soll.

Kühlung durch Radiation

Die Kühlung durch Radiation (Schnellrückkühlung mit Stützdruck) hat erhebliche Vorteile gegenüber der Kühlung durch Evaporation. Bei der Schnellrückkühlung mit Stützdruck, wird der Druckbehälter durch außenliegende Kühlschlangen vollflächig mit kaltem Wasser gekühlt. Bevor die Kühlung nach der Sterilisierphase aktiviert wird, wird der im Druckbehälter befindliche Dampf durch steril-filtrierte Druckluft ersetzt. Die Druckluft verhindert in der Kühlphase zuverlässig das Kochen der Flüssigkeit. Die Wärme wird aus der Flüssigkeit durch Radiation an die kalten Wandungen des Druckbehälters abgegeben und die Flüssigkeit somit abgekühlt.

Die Schnellrückkühlung mit Stützdruck erlaubt einen erheblichen Produktivitätsgewinn, da die Prozesszeiten im Vergleich zur Selbstabkühlung deutlich verringert werden. Während die Selbstabkühlung noch bis zu 10 Stunden für einen gesamten Autoklavier-Vorgang benötigt, kann die Rückkühlzeit mit der Schnellrückkühlung mit Stützdruck, je nach Beladungsmenge, um bis zu 60% reduziert werden.Des Weiteren werden alle bei der Evaporationskühlung beschriebenen Gefahren und Nachteile (Siedeverzug, Flüssigkeitsverlust, Überkochen, keine Kühlung bei fest verschlossenen Flaschen) zuverlässig beseitigt, da kein Kochen der Flüssigkeit mehr stattfindet. Bei dieser Art der Kühlung dürfen die Flaschen bis zum maximalen Füllstand gefüllt werden (Produktivitätsgewinn 50 bis 70%), es dürfen sogar fest verschlossene Flaschen verwendet werden. Ein Öffnen oder Anlüften der Flaschen ist nicht notwendig.

Prozesszeiten weiter optimieren

Moderne Autoklaven bieten die Möglichkeit, die Kühlung von Flüssigkeiten in Modulen weiter zu optimieren. Dies erhöht die Produktivität zusätzlich, hat aber auch Einfluss auf die Qualität der zu sterilisierenden Flüssigkeiten. Viele Flüssigkeiten enthalten Inhaltsstoffe, die nicht sehr hitzestabil sind. Die Flüssigkeiten sollen zwar sterilisiert werden, die Zeit in der die Flüssigkeiten der Hitzeeinwirkung ausgesetzt werden soll aber so gering wie möglich gehalten werden, um hitzelabile Inhaltsstoffe nicht negativ zu beeinflussen.

Modul 1 - Radialventilator

Der Radialventilator erzeugt während der Kühlphase einen Luftstrom im Druckbehälter des Autoklaven. Dieser Luftstrom zwingt die Wärme aus den Flaschen an die durch die Schnellrückkühlung mit Stützdruck gekühlten Wandungen des Druckbehälters. Durch dieses Verfahren kann die Rückkühlzeit verglichen mit der Selbstabkühlung um bis zu 70% reduziert werden.

Modul 2 - Ultracooler

Der Ultracooler ist ein zusätzlicher, wassergekühlter, Wärmetauscher der direkt im Druckbehälter des Autoklaven integriert ist. Hierdurch kann die Wärme von den Flaschen direkt dort entnommen werden wo sie sich auch befindet. Im Druckbehälter. Durch den deutlich verbesserten Wärmeübergang kann die Rückkühlzeit im Vergleich zur Selbstabkühlung um bis zu 90% reduziert werden.

Hinweis: Da Radialventilator und Ultracooler im inneren des Druckbehälters installiert werden, ist darauf zu achten, dass diese den Verfügbaren Nutzraum des Autoklaven nicht reduzieren.

Sterilisieren von Festkörpern und Abfällen in Vernichtungsbeuteln

Bei der Sterilisation von Festkörpern (z.B. Instrumente, leere Glaswaren, Pipetten-Spitzen in Boxen, Filter und Textilien) sowie bei der Vernichtung von Abfällen in Vernichtungsbeuteln, ist darauf zu achten, dass eine Dampfatmosphäre genau da entsteht wo sie auch benötigt wird. Nämlich am und im zu sterilisierenden Produkt. Viele Autoklaven entfernen Luft nicht zuverlässig aus dem Autoklaven und aus dem Produkt. Dort wo Luft im Autoklaven und im Produkt verbleibt, gibt es keine sterilisierende Wirkung, da nur Dampf die nötige Wärmeenergie transportiert, die Mikroorganismen zuverlässig inaktiviert.

Ineffektive Entlüftung

Abbildung 5 und 6 zeigen die ineffektive Entlüftung am Beispiel einer Box mit Pipetten-Spitzen sowie eines Vernichtungs-beutels. Wird der Autoklav einfach aufgeheizt, wird Luft aus diesem verdrängt und im Druckbehälter des Autoklaven entsteht eine Dampfatmosphäre während aber Luft im zu sterilisierenden Produkt verbleibt. Verbleibende Luft im Produkt verhindert, dass der Dampf dort eindringen kann wo seine Wärmeenergie benötigt wird, um eine sterilisierende Wirkung zu erreichen.

Luft bei gleicher Temperatur wie Dampf (z.B. 121C) beinhaltet ein Vielfaches weniger Wärmeenergie. Für Produkte, die nicht in einer Dampfatmosphäre sterilisiert werden können, gibt es zwar Heißluftsterilisatoren, diese sterilisieren aber bei höheren Temperaturen (180 bis 250C) und für eine sehr viel längere Zeit (bis zu mehreren Stunden Sterilisationszeit). Eine sterilisierende Wirkung von Luft bei typischerweise in Dampfsterilisatoren verwendeten Temperaturen von 121C bis 134°C und einer Sterilisationszeit von 3 bis 20 Minuten ist also praktisch nicht gegeben.

Effektive Entlüftung

Für die vollständige und reproduzierbare Luftentfernung aus dem Autoklaven und dem zu sterilisierenden Produkt muss ein fraktioniertes Vorvakuum verwendet werden. Hierfür wird der Autoklav mit einem Vakuum-System ausgestattet. In der Aufheizphase erfolgen Vakuum-Zyklen mit welchen die Luft aktiv entfernt wird gefolgt von Dampfstößen. In der Regel wird ein dreifach fraktioniertes Vorvakuum verwendet, je nach Produkt können aber auf mehr Fraktionen notwendig sein.

Trocknung für Festkörper - Superdry

Zur Trocknung werden Festkörper wie zum Beispiel Instrumente oder leere Glaswaren normalerweise nach dem Sterilisationsprozess in einen Trocknungsschrank gegeben. Moderne Autoklaven erlauben das Trocknen von Festkörpern direkt im Anschluss an den Sterilisationsprozess. Sterilisieren und Trocknen in einem Prozess. Ein weiteres Handling des Sterilisationsguts mit Rekontaminations-Gefahr ist nicht notwendig.

Sterilisation von biologischen Gefahrstoffen

Die Sterilisation von biologischen Gefahrstoffen ist eine besondere Herausforderung. Während der Aufheizphase wird die sich im Autoklaven befindende Luft durch Dampf ersetzt. Hierfür wird die Luft aus dem Autoklaven verdrängt und in den Raum abgegeben in dem der Autoklav installiert ist.

Die TRBA 100 - Technische Regeln für biologische Arbeitsstoffe fordert, dass Prozessabluft aus einem Autoklaven in Laboren ab der Sicherheitsstufe S2 behandelt werden muss, da diese Abluft durch Mikroorganismen aus dem zu sterilisierende Produkt kontaminiert sein könnte. Hierfür ist ein geeignetes Verfahren zu verwenden. Für Autoklaven ist dies in der Regel die Filtration. Hierfür wird der Autoklav mit einem Abluftfilter ausgestattet. Sämtliche aus dem Autoklaven verdrängte Luft wird über den Filter gleitet und Mikroorganismen werden in diesem zurück gehalten. Der Filter wird während des Sterilisationsprozesses "in-line" mit sterilisiert werden, um die darin zurückgehaltenen Mikroorganismen zu inaktivieren.Die TRBA 100 behandelt nur die aus dem Autoklaven abgegebene Abluft, nicht aber das anfallende Kondensat. Während des Sterilisationsprozesses kondensiert Dampf auf dem Produkt und wird somit wieder zu Wasser (Kondensat). Dieses Wasser kann potenziell ebenfalls durch Mikroorganismen kontaminiert sein. Daher muss das Kondensat während des Sterilisationsprozesses im Autoklaven verbleiben und muss ebenfalls "in-line" sterilisiert werden bevor dieses nach erfolgreicher Sterilisation in den Abfluss gegeben wird.

Qualifizierung und Validierung

Bei der Qualifizierung wird geprüft, ob ein Gerät für seine vorgesehene Verwendung geeignet ist und ob ein Prozess, z.B. ein Sterilisationsprozess, unter Berücksichtigung des zu sterilisierende Produktes mit dem immer gleichen (reproduzierbaren) Ergebnis, einem sterilen Produkt, durchgeführt werden kann.

Grundsätzlich gliedert sich der Qualifizierungsprozess in drei hauptsächliche Teile:

- IQ - Installation Qualifizierung

Prüfung, ob ein Gerät entsprechend den Spezifikationen hergestellt und installiert wurde.

- OQ - Funktions-Qualifizierung

(Operational Qualification)Prüfung, ob ein Gerät grundsätzlich entsprechend den Spezifikationen funktioniert.

- PQ - Leistungs-Qualifizierung (Performance Qualification)

Prüfung, ob ein Gerät mit zu verarbeitenden Produkt entsprechend den Spezifikationen funktioniert.

Ziel der Qualifizierung und Validierung ist der dokumentierte Nachweis, dass ein Gerät für seine vorgesehene Nutzung geeignet ist.

Die sterilisierende Wirkung eines Dampfsterilisationsprozesses wird hierbei in der OQ (leere Kammer) und PQ (mit Produkt) durch externe Messmittel für Temperatur und Druck sowie unter Zuhilfenahme von Bioindikatoren basierend auf Bacillus Stearothermophilus nachgewiesen. Während externe Messmittel für Temperatur und Druck, den Nachweis bringen, dass die Steuerung des Autoklaven verlässliche Werte anzeigt und dokumentiert sowie den Sterilisationsprozess innerhalb der zu definierenden Toleranzen durchführt, bringen Bioindikatoren den biologischen Wirksamkeitsnachweis. Für die Platzierung der Bioindikatoren ist zu bestimmen, in welchen Bereichen des Sterilisiergutes es am schwierigsten ist, die biologische Wirksamkeit zu erreichen. Genau in diesen Bereichen müssen Bioindikatoren platziert werden, um sozusagen den "worst case" abzudecken. Alle Schritte einer IQ, OQ und PQ sind detailliert zu dokumentieren. In jedem Fall ist für die Durchführung einer IQ, OQ und PQ eine enge Abstimmung zwischen Anwender und Hersteller notwendig.

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Die Systec GmbH ist Hersteller von Autoklaven (Dampfsterilisatoren) insbesondere Laborautoklaven, Medienpräparatoren und Abfüllgeräten für Flüssigmedien und Mikrobiologische Nährmedien. Systec entwickelt und fertigt, zertifiziert nach ISO 9001, eine breite Produktpalette für das moderne Labor in Wissenschaft und Forschung sowie der Biotechnologie, Pharmazie, Qualitätskontrolle und Produktion.
Systec GmbH
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